IPTG诱导原理(原核表达)及实验步骤

更多蛋白表达系统/原理/实验流程步骤/FAQ相关内容请访问:蛋白表达专题

在原核蛋白表达体系中,如E.coli(大肠杆菌表达系统),外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达,本文详细讲述了常用诱导剂IPTG诱导原理,对外源蛋白诱导表达原理以及实验步骤。

下载

原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列,且密集于染色体上,共同形成一个转录单位——操纵子,也称基因表达的协同单位。E。coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基转移酶(transacetylase);此外还有调控基因:操纵序列O(operator)、启动序列P(promoter);而I(编码Lac阻遏物,Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

乳糖操纵子结构基因

乳糖操纵子结构基因

IPTG诱导原理

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态,Lac阻遏物(即下图中的阻遏蛋白)能与操纵基因O结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,阻止了转录的路径,从而抑制转录启动。而当有诱导剂(这里指IPTG)存在时,诱导剂可与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白构象发生变化,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来,RNA聚合酶不再受阻碍,启动子P开始发生转录,启动反应开始发生转录。

在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中,通常选用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,IPTG是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

IPTG诱导表达原理图

IPTG诱导表达原理图

IPTG诱导表达实验方法

材料

试剂和培养基 配料
LB(Luria—Bertani)培养基 酵母膏(Yeast extract) 5g
蛋白胨(Peptone) 10g
NaCl 10g
琼脂(Agar) 1-2%
蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0
IPTG 贮备液 2g IPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存
凝胶电泳加样缓冲液 50mmol/L Tris-CL(pH6.8)
50mmol/L DTT
2%SDS(电泳级)
0.1%溴酚蓝
10%甘油

原核表达鉴定详细实验步骤

  1. 表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择
  • 拿到质粒,离心(3000r/min;2min)
  • 在质粒中加入TE【使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng,据此确定加入TE的量】,一般为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)
  • 将质粒与TE混匀,吸取2μL混液与感受态细胞混匀
  • 将感受态细胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 取出后立即放入水浴锅中(42℃),热激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
  • 放入摇床(37℃;  195r) 中,  30nim至60min; (最佳45min)
  • 取出离心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清悬浮沉淀,吸取50μL悬液涂平板,【先将对应抗性的平板放入培养箱(37℃)中预热20min】
  • 把平板放入培养箱(37℃),过夜(12h至16h)

2.  表达鉴定第二天的任务,注意Pcold表达载体的表达温度

  • 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”
  • 将试管放入摇床(37℃;195r) 中,【单抗3h左右;双抗4h左右;刚开始用可见分光光度计测OD值;熟练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,刚刚看不见枪头即可)】,测OD值(0.6至0.8)
  • 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存
  • 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适,可根据日后表达摸索】
  • 视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX:15℃表达过夜;25℃表达6h;37℃表达3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃表达过夜;“2”“3”试管37℃表达3h至4h)。Pcold:【全部15℃表达过夜】

3。 表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度

  • 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中,【若OD值不一样,值小的可多取】离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀【沉淀少的,可再取菌液离心,尽量使沉淀量接近】
  • 在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀,离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀
  • 在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况下,加入量不变;当溶质多且粘稠时,应使加入量增大,为降低粘度也可减少上液量】
  • 放入煮样器(100℃) 25min
  • 取出后离心(6000r/min)  3min,  电泳检测。
  • 蛋白表达量不错,进行蛋白纯化;蛋白表达量低或者没表达,可参考原核表达FAQ相对应解决方案解决。

4. 蛋白纯化:见蛋白纯化专题

仅供科研

联系我们

电话:(025)5889-4959

咨询:Sales@customefi.com

地址:南京市高新开发区星火路10号

六合宝典 六合在线 六合宝典 六合宝典 六合在线 六合宝典 六合宝典 六合在线 六合在线 六合在线